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生物制品中的灭活剂残留分析检测
生物制品，包括疫苗、血液制品、细胞与基因治疗产品等，是现代医学领域用于预防和治疗重大疾病的关键武器。在其生产过程中，为确保产品的安全性和消除潜在的病毒污染风险，病毒灭活/验证是一道至关重要的工艺步骤。
β-丙内酯BPL、甲醛、戊二醛等化学灭活剂因其高效的病毒灭活能力而被广泛应用。但这些灭活剂在发挥效用后，若未能从终产品中彻底去除，其本身也可能作为一种化学残留物，引入新的安全风险。
灭活剂残留检测方法案例
微源检测药物杂质研究团队将结合过往案例经验，综述生物制品中灭活剂残留分析的研究进展，重点探讨不同灭活剂的检测策略、方法原理、技术优势与挑战，以期为相关产品的工艺开发与质量控制提供参考和借鉴。
甲醛
甲醛在疫苗生产中常作为灭活剂，但随疫苗注入机体后，会对机体产生一系列刺激性反应，需对疫苗中甲醛残留量进行严格控制。
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分析方法 |
类型 |
原理 |
灵敏度 |
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分光光度 |
乙酰丙酮法 |
甲醛在醋酸-醋酸铵缓冲溶液中，与乙酰丙酮反应生成黄色化合物3，5-二乙酰基-1，4-二氢吡啶，该化合物在410nm波长处有最大吸光度值，通过比色定量可计算疫苗中甲醛残留量。 |
1μg/mL[1] |
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品红亚硫酸法 |
亚硫酸离子与副品红生成无色的希夫试剂，再与醛作用生成紫色络合物，加硫酸后生成蓝色化合物，是甲醛的特有反应，通过在 570nm波长处比色测定甲醛含量。 |
25μg/mL[2] |
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液相色谱 |
2,4-二硝基苯肼柱前衍生化 |
甲醛和2，4-二硝基苯肼生成2，4-二硝基苯腙，在360nm下采集衍生物响应。 |
0.03μg/mL[3] |
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液质联用 |
2,4-二硝基苯肼柱前衍生化 |
甲醛和2，4-二硝基苯肼生成2，4-二硝基苯腙，通过LCMS-MRM测定2，4-二硝基苯腙含量。 |
0.01μg/mL |
🔺 图1.液质联用测定甲醛方法对照溶液典型图谱
β-丙内酯
与甲醛比较，BPL对病毒具有更强的灭活作用，同时不破坏病原体蛋白的免疫原性；还可降低生物制品中残留宿主细胞DNA的含量，并具有极易水解成无毒无害物质的特性，目前在国外应用于多种疫苗的灭活。
但BPL可引起碱基烷基化或酰基化，导致DNA损伤，如去嘌呤突变，并发生A至T转位。在实验动物中，即使单次给药，BPL也显示出高度致瘤性、遗传毒性和致癌性。[4]
微源检测开发了GC法测定某疫苗中β-丙内酯的分析方法。利用AgilentDB-624毛细管柱，通过直接进样、程序升温的方式测定X疫苗中β-丙内酯含量。通过优化起始柱温、柱流量、进样体积、分流比等参数，开发方法灵敏度＜0.5μg/ml。同时通过模拟，分别测定了疫苗灭活过程中BPL含量、疫苗水解过程中BPL含量及其原液中的残留量。
🔺 图2.BPL对照溶液和样品限度加标溶液典型图谱
针对用于测定失活冠状病毒疫苗中β-丙内酯(BPL) 残留量，药物检测技术团队同时开发了GCMS方法。采用DB-5MS UI毛细管柱，以SIM模式进行采集。BPL对照品溶液使用乙腈溶解稀释，样品用乙酸乙酯提取，处理后的上清液直接用于GC-MS进样分析。线性范围为0.2~20 μg/mL，检出限和定量限分别为0.68ppm和2.06ppm。
🔺 图3.GCMS-BPL对照溶液和样品溶液典型图谱
胍基离序盐
胍基离序盐（Guanidium Based Chaotropic Salts）通常为核酸提取液的主要成分，用于病毒灭活的GBCS主要为含有异硫氰酸胍（Guanidinium Isothiocyanate，GI）、苯酚或Tritonx-100、硫氰酸胍（Guanidium thiocyanate，GTC）等的缓冲液。[5]市售的胍基制剂由于其各成分的比例及活性成分的含量不同，故其需要测定组分也不同。
🔺 图4.硫氰酸根离子标准溶液和加标溶液典型图谱
团队开发了离子色谱法测定了某核酸提取液中的硫氰酸胍的含量分析方法，选用Dionex IonPac AS11-HC阴离子交换柱，样液通过固相萃取后进样，方法灵敏度0.05μg/mL，方法回收率和重现性良好。
项目经验
已有研究表明，残留的灭活剂可能导致产品活性降低、引发不必要的免疫原性反应，甚至产生细胞毒性和基因毒性，严重威胁用药患者的健康。因此建立并严格执行生物制品中灭活剂残留的监控标准，已成为全球药品监管机构的共识要求。
微源检测实验室专注杂质研究，针对生物制品中的灭活剂残留分析有着丰富项目经验，可以针对疫苗等不同样品灵活选择合适的分析方法，为生物药工艺残留检测分析提供高效的解决方案和全面的研究策略，已帮助百余家药企完成质量申报。
参考文献
[1]田文莉，杨江山，万亚芬，等.乙酰丙酮分光光度法检测亚单位流感疫苗中的甲醛含量[J]. 中国生物制品学杂志，2012，25（4）：510-512.
[2]阎立英.乙脑灭活疫苗游离甲醛含量的测定[J]. 华北煤炭医学院学报，2010，12（4）：501-501.
[3]HSIAO Y H，HUANG Y T，HUNG C Y，et al. Pyk2 via S6K1 regulates the function of androgen receptors and the growth of prostate cancer cells[J]. Endocr Relat Cancer，2016，23（8）： 651-663.
[4]SPANINGER E，BREN U. Carcinogenesis of β-propiolactone： A computational study［J］. Chem Res Toxicol，2020，33（3）： 769-781
[5]史大庆，肖永珍，等.5种常用病毒灭活剂的应用概述[J].广东畜牧兽医科技，2018，48（4）：66-71
